一种利用改良的叶盘转化法提高苹果CRISPR/Cas9系统编辑效率的方法

本发明涉及生物，具体涉及一种用改良的叶盘转化法提高苹果crispr/cas9系统编辑效率的方法。

背景技术：

1、crispr/cas9是一种使用广泛的基因编辑技术，以crispr/cas9主导的基因编辑系统经细菌防御外源核酸的机制开发而来，由cas蛋白，sgrna和启动子组成。可通过根癌农杆菌递送载体到受体植物基因组中，表达cas9蛋白和sgrna，进而对目的基因进行编辑。

2、根癌农杆菌介导的植物转化-叶盘转化法是目前使用最广泛的遗传转化途径之一，自然条件下，根癌农杆菌能够感染双子叶植物的受伤部位，将自身ti质粒上具有转座功能的dna片段整合到受体细胞基因组中进行表达。根癌农杆菌介导的遗传转化法正是根据这一特性开发而来，可借助根癌农杆菌的转化方式，获得转基因植株。

3、高效稳定的转化方法是进行植物基因编辑的前提条件，而现有的叶盘转化法使用的培养基并不完全适用于木本植物组织培养，侵染效果不强，使用的培养基不能充分满足叶片再生的需求，无法诱导出分化能力强的愈伤组织和再生芽。并且现有的叶盘转化法在crispr/cas9系统介导的遗传转化实验过程中存在体系不稳定、转化效率低、试验重复性差等问题，导致苹果转基因材料获得困难，苹果基因编辑数据单一。因此亟需一种能够适用于木本植物组织培养，增强基因的遗传转化效率，提高苹果crispr/cas9系统编辑效率的改良叶盘转化法。

技术实现思路

1、为实现上述目的，本发明的目的是提供一种利用改良的叶盘转化法提高苹果crispr/cas9系统编辑效率的方法，以解决现有叶盘转化法遗传转化效率和基因编辑效率较低的问题。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一方面，提供了一种培养基组合，包括：侵染培养基、脱分化启动培养基、愈伤诱导培养基、芽分化培养基和芽增殖培养基；

4、所述侵染培养基以wpm培养基、蔗糖、葡萄糖、4-吗啉乙磺酸和硫酸镁为活性成分；

5、所述脱分化启动培养基以wpm培养基、蔗糖、葡萄糖、水解酪蛋白、水解乳清蛋白、2,4-二氯苯氧乙酸、氨氯吡啶酸、植物凝胶、4-吗啉乙磺酸和聚乙烯吡咯烷酮为活性成分；

6、所述愈伤诱导培养基以wpm培养基、蔗糖、水解酪蛋白、水解乳清蛋白、噻苯隆、6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、植物凝胶、4-吗啉乙磺酸、特美汀和聚乙烯吡咯烷酮为活性成分；

7、所述芽分化培养基以改良型ms培养基、硫酸铜、噻苯隆、6-苄氨基嘌呤、吲哚丁酸、植物凝胶、4-吗啉乙磺酸、特美汀、聚乙烯吡咯烷酮和潮霉素为活性成分；

8、所述芽增殖培养基以ms培养基、硫酸铜、蔗糖、椰子粉、6-苄氨基嘌呤、吲哚丁酸、植物凝胶、4-吗啉乙磺酸、特美汀和潮霉素为活性成分。

9、所述侵染培养基配置方法为：1.0-5.0g/l wpm培养基+1-30g/l蔗糖+1-20g/l葡萄糖+0.5g/l 4-吗啉乙磺酸+0.1-1g/l硫酸镁；

10、所述脱分化启动培养基配置方法为：1.0-5.0g/l wpm培养基+1-30g/l蔗糖+1-20g/l葡萄糖+0.1-0.5g/l水解酪蛋白+0.1-0.5g/l水解乳清蛋白+0.1-2.0mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸+0.1-2.0mg/l氨氯吡啶酸+2.9g/l植物凝胶+0.5g/l 4-吗啉乙磺酸+0.2-2g/l聚乙烯吡咯烷酮，ph＝5.8；

11、所述愈伤诱导培养基配置方法为：1.0-5.0g/l wpm培养基+30g/l蔗糖+00.1-0.5g/l水解酪蛋白+0.1-0.5g/l水解乳清蛋白+0.1-2.0mg/l噻苯隆+0.1-2.0mg/l 6-苄氨基嘌呤+0.1-2.0mg/l萘乙酸+2.9g/l植物凝胶+0.5g/l 4-吗啉乙磺酸+320mg/l特美汀+0.2-2g/l聚乙烯吡咯烷酮，ph＝5.8；

12、所述芽分化培养基配置方法为：1.0-5.0g/l改良型ms培养基+0.1-0.5mg/l硫酸铜+30g/l蔗糖+0.1-2.0mg/l噻苯隆+0.1-2.0mg/l 6-苄氨基嘌呤+0.1-2.0mg/l吲哚丁酸+2.9g/l植物凝胶+0.5g/l 4-吗啉乙磺酸+320mg/l特美汀+0.2-2g/l聚乙烯吡咯烷酮+3mg/l潮霉素，ph＝5.8；

13、所述芽增殖培养基配置方法为：1.0-5.0g/l ms培养基+0.05-0.5mg/l硫酸铜+30g/l蔗糖+100ml/l椰子粉+0.1-1.0mg/l 6-苄氨基嘌呤+0.1-1.0mg/l吲哚丁酸+2.9g/l植物凝胶+0.5g/l 4-吗啉乙磺酸+320mg/l特美汀+3mg/l潮霉素，ph＝5.8。

14、所述改良型ms培养基中硝酸铵和硝酸钾含量分别为ms培养基中硝酸铵和硝酸钾含量的1/2。

15、本发明第二方面，提供了上述培养基组合在改良叶盘转化法中的应用。

16、本发明第三方面，提供了利用上述培养基组合进行叶盘转化的方法，包括如下步骤：

17、(1)将经yeb培养基活化的农杆菌加入侵染培养基中制备侵染液，剪取转化受体的组培苗叶片置于抗褐化剂中，使用无菌手术刀片垂直主叶脉切割2-3刀，置于侵染液中浸泡5-11min后转入脱分化启动培养基共培养；

18、(2)共培养结束后，将叶片转至愈伤诱导培养基，将推迟培养的叶片转至附加潮霉素的愈伤诱导培养基上，生成抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织转至芽分化培养基分化出抗性不定芽；

19、(3)待不定芽生长至1-2cm时，使用手术刀片将其从叶片剥离，转移至芽增殖培养基继代培养。

20、所述利用本发明提供的培养基组合进行叶盘转化的方法中共培养的目的是让农杆菌充分侵染叶片伤口部位，使得目的基因整合入伤口部位的细胞中。

21、所述推迟培养的目的是伤口部位含有目的基因的细胞在愈伤诱导培养基上生成含有目的基因的愈伤组织(具有抗潮霉素特性)。

22、所述农杆菌侵染后，即共培养结束后，含有目的基因的细胞需要一段时间进行分裂分化，使得目的基因充分表达，才能具备抵抗潮霉素的能力。另外，受到农杆菌侵染的叶片生理状态很虚弱，也需要充分调整，才可利于生成状态良好的抗性愈伤组织。因此，在本发明提供的培养基组合进行叶盘转化的方法中，共培养结束后叶片需要先在不加潮霉素的愈伤诱导培养基上缓冲一段时间，再挪到含潮霉素的愈伤诱导培养基上，在诱导愈伤的同时，通过潮霉素作用筛选出的含有目的基因的愈伤组织。

23、步骤(1)中所述农杆菌为携带标记载体或目标敲除载体的农杆菌。

24、步骤(1)中所述转化受体为苹果‘gala’组培苗叶片。

25、步骤(1)中所述抗褐化剂为10-100mg/l抗坏血酸+15-150mg/l柠檬酸。

26、本发明第四方面，提供了上述方法在如下(1)或(2)中的应用：

27、(1)提高苹果愈伤组织遗传转化效率；

28、(2)提高苹果crispr/cas9系统编辑效率；

29、优选的，所述提高苹果愈伤组织遗传转化效率通过检测egfp，ruby标记蛋白递送效率来体现

30、优选的，所述提高苹果crispr/cas9系统编辑效率是指可获得多种类型的功能基因突变体，增加苹果基因编辑数据。

31、所述多种类型的功能基因突变体为纯合突变体、杂合体和嵌合体中的任一种。

32、本发明的有益效果是：

33、本发明根据木本植物组织培养养分需求，提供了一种培养基组合，可以满足苹果叶片再生的需求，诱导出分化能力强的愈伤组织和再生芽，克服了苹果遗传转化效率低的难题。基于该培养基套餐改良的叶盘转化法可以显著提高苹果crispr/cas9系统编辑效率，能够高效递送crispr/cas9敲除载体，获得包括缺失，替换，插入等不同突变类型的纯合体和杂合体植株，编辑效率高达92.3％。本发明提供的方法对于解析苹果遗传机制，改良农艺性状以及利用基因编辑技术进行种质创新提供了新思路。